一文看懂稳态/瞬态荧光光谱原理与应用

一、荧光光谱仪介绍

稳态/瞬态荧光光谱

1、原理

在吸收紫外和可见电磁辐射的过程中，分子受激跃迁至激发电子态，大多数分子将通过与其它分子的碰撞以热的方式散发掉这部分能量，部分分子以光的形式放射出这部分能量，放射光的波长不同于所吸收辐射的波长。后一种过程称作光致发光。

分子发光包括 荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为 分子荧光光谱法。

被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪。一个激发，一个发射，采用双单色器系统，可分别测量激发光谱和荧光光谱。目前国内外荧光光谱仪示意图如图一：

图一 荧光光谱仪原理示意

2、分类

荧光光谱仪是测定材料发光性能的基本设备。通用荧光光谱仪大致可分为3种：

(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可见波段的稳态光谱仪。

(2) 扩展型：覆盖200-1700 nm波段的紫外可见-近红外稳态光谱仪。

(3) 综合型：覆盖上述两个波段，同时可测瞬态光谱的光谱仪。

3、主要部件

光源：提供不同波长的激发光

单色器：激发单色器将光源发出的复色光变成单色光，发射单色器将发出的荧光与杂散光分离，防止杂散光对荧光测定产生干扰。

狭缝：控制光通量

检测器：光电倍增管

样品池：四面透明正方形石英池，长1cm，宽1cm

测试仪器：稳态/瞬态荧光光谱

4、主要用途

（1）荧光激发光谱和荧光发射光谱

（2）同步荧光（波长和能量）扫描光谱

（3）3D（Ex Em Intensity)

（4）Time Base和CWA(固定波长单点测量）

（5）荧光寿命测量，包括寿命分辨及时间分辨

（6）计算机采集光谱数据和处理数据（Datamax和Gram32)

稳态/瞬态荧光光谱的应用领域

二、荧光与磷光

1、荧光与磷光现象

2、荧光与磷光产生原理

荧光：第一激发单重态的最低振动能级→基态

磷光：第一激发三重态的最低振动能级→基态

3、激发与发射光谱

任何荧光化合物都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱。

激发光谱反映了某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系；

发射光谱反映了某一固定激发波长下所测量的荧光的波长分布。

激发光谱和荧(磷)光光谱

荧光光谱能够提供激发谱、发射谱、峰位、峰强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振度等信息，荧光分析定性和定量的基础。

荧光光谱的特点：

（1）Stokes位移。激发光谱与发射光谱之间有波长差，发射光谱波长比激发光谱波长长；

（2）发射光谱的形状与激发波长无关；

（3）镜像规则，荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。

4、荧光寿命

荧光物质具有两个重要的发光参数： 荧光寿命和 荧光量子产率。

荧光寿命（τ）是指当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间，它表示粒子在激发态存在的平均时间，通常称为激发态的荧光寿命。与稳态荧光提供一个平均信号不同，荧光寿命提供的是激发态分子的信息，前者可以告诉你事情发生了，而后者可以告诉你为什么发生。

荧光寿命示意图

荧光寿命与物质所处微环境的极性、黏度等有关，可以通过荧光寿命分析直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级，这正好是分子运动所发生的的时间尺度，因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程，例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。荧光寿命分析在光伏、法医分析、生物分子、纳米结构、量子点、光敏作用、镧系元素、光动力治疗等领域均有应用。

荧光寿命的测定技术 有时间分辨单光计数技术(TCSPC)、相调法、闪频法。其中TCSPC具有灵敏度高、测定结果准确、系统误差小的优点，是目前最流行的的荧光寿命测定方法。

5、荧光量子产率

荧光量子产率（φf ）是荧光物质另一个基本参数，它表示物质发生荧光的能力，数值在0~1之间。荧光量子效率是 荧光辐射与其他辐射和非辐射跃迁竞争的结果。

式中， kf为荧光发射过程的速率常数， ∑k i 为其他有关过程的速率常数总和。一般来说， k f 主要决定于化学结构，而 ∑ki主要决定于化学环境，同时也与化学结构有关。

6、分子结构与荧光

并不是所有的分子都能产生荧光，分子产生荧光必须具有：合适的结构和一定的荧光量子产率。荧光产生与分子结构的关系如下：

（1）电子跃迁类型。大多数荧光化合物都是由π→π*或n→π*跃迁激发，然后经过振动弛豫或其他非辐射跃迁，在发生π*→π或π*→n跃迁而产生荧光，其中π*→π荧光效率最高。

（2）共轭效应。含有π*→π跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。

（3）取代基效应。苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生，而给电子基会使荧光增强。

（4）平面刚性结构。具有平面刚性结构的有机分子大多具有强烈荧光，因为该结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用。

三、荧光分析

荧光分析就是基于物质的光致发光现象而产生的荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析方法。目前，也广泛地作为一种表征技术来研究体系的物理、化学性质及其变化情况，例如生物大分子构象及性质的研究。

荧光光谱适用于固体粉末、晶体、薄膜、液体等样品的分析。根据样品分别选配石英池（液体样品）或固体样品架（粉末或片状样品）。

荧光分析的优点：（1）灵敏度高；（2）选择性强；（3）试样量少、方法简单；（4）提供较多的物理参数。但是也存在应用范围不够广泛、对环境敏感（干扰因素多）等缺点。

1、定性分析

不同结构荧光化合物都有特征的激发光谱和发射光谱，因此可以将荧光物质的激发光谱与发射光谱的形状、峰位与标准溶液的光谱图进行比较，从而达到定性分析的目的。

2、定量分析

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比：F=Kc。其中，F为荧光强度，c为荧光物质浓度，K为比例系数。这就是荧光光谱定量分析的依据。

上述关系不适用于荧光物质浓度过高时，荧光物质浓度过高，其荧光强度反而降低。原因有：

（1）内滤效应。一是，当溶液浓度过高时，溶液中杂质对入射光的吸收作用增大，相当于降低了激发光的强度。二是，浓度过高时，入射光被液池前部的荧光物质强烈吸收，处于液池中、后部的荧光物质，则因受到入射光大大减弱而使荧光强度大大降低；而仪器的探测窗口通常对准液池中部，从而导致检测到的荧光强度大大降低。

（2）相互作用。较高浓度溶液中，可发生溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的二聚物或其他溶质分子的复合物，从而导致荧光光谱的改变和/或荧光强度下降。当浓度更大时，甚至会形成荧光物质的基态分子聚集体，导致荧光强度更严重下降。

（3）自淬灭。荧光物质的发射光谱与其吸收光谱呈现重叠，便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象，导致荧光强度下降。溶液浓度增大时会促使再吸收现象加剧。

3、影响荧光强度的外部因素